Research and clinical applications of recombinant adeno-associated virus (rAAV) significantly increased in recent years alongside regulatory approvals of rAAV gene therapy products. To date, all rAAV vectors as well as AAV empty capsids are produced in eukaryotic cells. We explored a new route to generate AAV capsids with the aim to analyze capsid assembly in a chemically defined setting and pave the way for new production methods and applications based on AAV virus-like particles (VLPs). We generated these empty capsids by bacterial expression and subsequent concomitant protein refolding and VLP formation. AAV serotype 2 structural protein VP3 was expressed in Escherichia coli. VLPs formed as demonstrated by dynamic light scattering, atomic force microscopy, and ELISA. Furthermore, VLPs internalized into human HeLa cells. To extend the application range of the VLPs, we tested peptide insertions, at the genetic level, in a surface loop (amino acid position 587) or at the C-terminus of VP3 and these variants also formed VLPs. VLPs developed without assembly-activating protein (AAP), but adding purified recombinant AAP to the refolding process increased capsid yield. Our findings offer a new route to understand AAV assembly biology and open a toolbox for AAV production strategies that might enable capsid display for vaccination and matching of capsids with cargoes at large scale and low cost.

中文翻译：

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腺相关病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达和化学定义的衣壳装配。

近年来，随着重组腺相关病毒（rAAV）基因治疗产品的监管部门批准，重组腺相关病毒（rAAV）的研究和临床应用显着增加。迄今为止，所有rAAV载体以及AAV空衣壳均在真核细胞中产生。我们探索了一种生成AAV衣壳的新途径，目的是在化学定义的环境下分析衣壳装配，并为基于AAV病毒样颗粒（VLP）的新生产方法和应用铺平道路。我们通过细菌表达以及随后伴随的蛋白质重折叠和VLP形成产生了这些空衣壳。AAV血清型2结构蛋白VP3在大肠杆菌中表达。通过动态光散射，原子力显微镜和ELISA证明了形成的VLP。此外，VLP内化到人类HeLa细胞中。为了扩展VLP的应用范围，我们在基因水平，表面环（氨基酸位置587）或VP3的C端测试了肽插入，这些变体也形成了VLP。VLP的开发没有装配激活蛋白（AAP），但在重折叠过程中添加了纯化的重组AAP可提高衣壳产量。我们的发现为了解AAV组装生物学提供了一条新途径，并为AAV生产策略打开了一个工具箱，该工具箱可以使衣壳展示，以进行疫苗接种以及衣壳与货物的大规模，低成本匹配。但在重折叠过程中添加纯化的重组AAP可提高衣壳产量。我们的发现为了解AAV组装生物学提供了一条新途径，并为AAV生产策略打开了一个工具箱，该工具箱可以使衣壳展示，以进行疫苗接种以及衣壳与货物的大规模，低成本匹配。但在重折叠过程中添加纯化的重组AAP可提高衣壳产量。我们的发现为了解AAV组装生物学提供了一条新途径，并为AAV生产策略打开了一个工具箱，该工具箱可以使衣壳展示，以进行疫苗接种以及衣壳与货物的大规模，低成本匹配。