Single-molecule localization microscopy (SMLM) enabling the investigation of individual proteins on molecular scales has revolutionized how biological processes are analysed in cells. However, a major limitation of imaging techniques reaching single-protein resolution is the incomplete and often unknown labeling and detection efficiency of the utilized molecular probes. As a result, fundamental processes such as complex formation of distinct molecular species cannot be reliably quantified. Here, we establish a super-resolution microscopy framework, called quantitative single-molecule colocalization analysis (qSMCL), which permits the identification of absolute molecular quantities and thus the investigation of molecular-scale processes inside cells. The method combines multiplexed single-protein resolution imaging, automated cluster detection, in silico data simulation procedures, and widely applicable experimental controls to determine absolute fractions and spatial coordinates of interacting species on a true molecular level, even in highly crowded subcellular structures. The first application of this framework allowed the identification of a long-sought ternary adhesion complex—consisting of talin, kindlin and active β1-integrin—that specifically forms in cell-matrix adhesion sites. Together, the experiments demonstrate that qSMCL allows an absolute quantification of multiplexed SMLM data and thus should be useful for investigating molecular mechanisms underlying numerous processes in cells.

单分子定位显微镜（SMLM）能够在分子规模上研究单个蛋白质，彻底改变了细胞中生物学过程的分析方式。但是，成像技术达到单蛋白分辨率的主要限制是所用分子探针的标记和检测效率不完整，而且常常是未知的。结果，不能可靠地量化基本过程，例如不同分子种类的复杂形成。在这里，我们建立了一个超分辨率显微镜框架，称为定量单分子共定位分析（qSMCL），它可以识别绝对分子数量，从而研究细胞内的分子尺度过程。该方法结合了多路单蛋白质分辨率成像，自动聚类检测，在计算机模拟数据程序中，以及广泛适用的实验控制中，即使在高度拥挤的亚细胞结构中，也可以在真实的分子水平上确定相互作用物种的绝对分数和空间坐标。该框架的首次应用使人们能够鉴定出一种长期寻找的三元粘附复合物，该复合物由塔林素，kindlin和活性β1-整联蛋白组成，该复合物特别形成于细胞基质粘附位点。在一起，实验表明qSMCL允许绝对量化的多重SMLM数据，因此对于研究细胞中众多过程的分子机制应该是有用的。即使在高度拥挤的亚细胞结构中 该框架的第一个应用程序允许鉴定长期存在的三元粘附复合物-由塔林，kindlin和活性β1-整联蛋白组成-特别是在细胞基质粘附位点形成。在一起，实验表明qSMCL允许绝对量化的多重SMLM数据，因此对于研究细胞中众多过程的分子机制应该是有用的。即使在高度拥挤的亚细胞结构中 该框架的第一个应用程序允许鉴定长期存在的三元粘附复合物-由塔林，kindlin和活性β1-整联蛋白组成-特别是在细胞基质粘附位点形成。在一起，实验表明qSMCL允许绝对量化的多重SMLM数据，因此对于研究细胞中众多过程的分子机制应该是有用的。